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Proyecto estudio del papel de la alfa sinucleina y las células madre mesenquimales de placenta en la enfermedad de Parkinson Investigadora Principal: Dra


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PROYECTO

Estudio del papel de la alfa sinucleina y las células madre mesenquimales de placenta en la enfermedad de Parkinson

Investigadora Principal: Dra. Ana Isabel Flores de la Cal, Grupo de Medicina Regenerativa del Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre

Colaborador: Dr. José Antonio Molina Arjona, neurólogo del Hospital 12 de Octubre
INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que, de forma lenta y progresiva, afecta al movimiento, el control muscular y el equilibrio. Se produce por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la zona del cerebro que se conoce como sustancia nigra. La dopamina es un mensajero químico responsable de transmitir señales entre la sustancia negra y el cuerpo estriado, para producir movimientos suaves y decididos. La pérdida de dopamina produce patrones anormales de activación nerviosa dentro del cerebro que causan deterioro del movimiento. Cuando aproximadamente el 60-80% de las células productoras de dopamina están dañadas aparecen los síntomas motores de la enfermedad.


La enfermedad de Parkinson afecta a unos cuatro millones de personas en todo el mundo. En España más de 100.000 personas padecen esta patología, y cada año surgen veinte nuevos casos de enfermos de Parkinson por cada 100.000 habitantes. Además de los trastornos motores la enfermedad de Parkinson cursa con numerosos síntomas no motores que afectan a la esfera cognitiva (demencia, deficit de atención, psicosis), sensorial (sensibilidad al dolor, anosmia), al humor (depresión, ansiedad), al sueño (insomnio, fatiga crónica) y al sistema nervioso autónomo (hipotensión ortostática, sudoración excesiva, problemas urinarios, estreñimiento).
Diversas hipótesis atribuyen la enfermedad a factores genéticos (se han reconocido algunos genes mutantes como responsables), metabólicos (estrés oxidativo) o ambientales (plaguicidas, aluminio). El 10 % de los pacientes muestran predisposición genética.
Histológicamente, la enfermedad se caracteriza por la presencia de los cuerpos de Lewy en las neuronas de la sustancia negra y el locus coeruleus, aunque también pueden aparecer en otras localizaciones del sistema extrapiramidal, como son los plexos entéricos de Auerbach y Meissner . Se trata de inclusiones intracitoplasmáticas compuestas por proteínas, ácidos grasos libres, esfingomielina y polisacáridos. El componente mayoritario de los cuerpos de Lewy son los agregados de la proteína alfa-sinucleína . A pesar de encontrarse en la mayoría de los compartimentos celulares, la presencia de alfa sinucleína es mayor en los terminales presinápticos y, así, se le atribuye un papel en el transporte vesicular y en la liberación de neurotransmisores . El hallazgo de mutaciones por cambio de aminoácido, así como duplicaciones en el gen SCNA, que codifica para alfa- sinucleína, en pacientes con enfermedad de Parkinson familiar, sugiere un papel relevante de alfa-sinucleína en la etiología de la enfermedad .
La proteína alfa-sinucleína se encuentra sin plegar a pH neutro, sin embargo, cuando se une a membranas o vesículas que contienen fosfolípidos ácidos adopta estructura de alfa-hélice. Bajo determinadas condiciones, alfa-sinucleína se agrega en forma de oligómeros que sufren una conversión gradual a estructuras fibrilares con plegamiento en hoja beta. Estas estructuras forman los cuerpos de Lewy y las evidencias apuntan a que son los intermediarios oligoméricos solubles los que son tóxicos para la célula.
Recientemente se ha publicado el hallazgo de que neuronas, procedentes de mesencéfalo embrionario, y que habían sido trasplantadas a enfermos de Parkinson al menos diez años antes de su muerte, presentaban cuerpos de Lewy alfa-sinucleína positivos . Estas observaciones clínicas sugieren que alfa-sinucleína podría, por un mecanismo tipo prión, ser transferida de célula a célula . Es posible detectar formas oligoméricas y monoméricas de alfa sinucleína en líquido cefalorraquídeo y en el plasma de individuos sanos y de pacientes de Parkinson . En cultivos celulares también se han detectado monómeros y agregados de alfa-sinucleína en el medio de cultivo .
Dado que en la enfermedad de Parkinson algunos de los síntomas no motores bastante frecuentes, tales como la pérdida del sentido del olfato (anosmia), las alteraciones del sueño y los síntomas gastrointestinales, pueden aparecer incluso años antes que los síntomas motores, se postula el posible origen de la enfermedad fuera del cerebro . El hallazgo de cuerpos de Lewy en dos lugares del tracto digestivo, esófago y colon , así como en el plexo submucoso y en el plexo mientérico en el sistema nervioso entérico (ENS) de pacientes de Parkinson , sustenta la posibilidad de que en los nervios periféricos pueda estar el origen de la enfermedad. El tracto digestivo y el cerebro están anatómicamente ligados a través del núcleo posterior del nervio vago, siendo ésta una de las regiones del cerebro que más tempranamente muestra la patología por cuerpos de Lewy en el transcurso de la enfermedad . Las neuronas del plexo submucoso y del plexo mientérico están expuestas, por su localización en el tracto digestivo, a numerosos agentes potencialmente dañinos, tales como los productos del metabolismo bacteriano, con capacidad de inducir estrés oxidativo y mecanismos inflamatorios . Aún más, la composición de la flora bacteriana de los individuos está influenciada por factores genéticos y por factores ambientales tales como la dieta .
En la Consulta de Trastornos de Movimiento del servicio de Neurología del Hospital 12 de Octubre se está realizando un tratamiento aprobado por las autoridades del hospital y las Agencias Española y Europea del Medicamento en enfermos con un grado avanzado de la enfermedad y sin otras alternativas terapéuticas. Este tratamiento se denomina Duodopa® y consiste en la administración de L Dopa en infusión continua en el duodeno. Para la administración del medicamento se requiere la realización de una dudodenostomía en los pacientes, lo que ofrece la posibilidad de obtener una biopsia (previo firma del consentimiento informado que se presenta) en el mismo acto terapéutico para estudiar la presencia de depósitos de alfa sinucleína a nivel de los plexos nerviosos submucosos y que podría ser útil para establecer medidas diagnósticas de la enfermedad de Parkinson en la práctica clínica. Este mismo procedimiento ya fue aprobado por el CEIC de este hospital para otro proyecto (“Estudio de un grupo de pacientes con enfermedad de Parkinson avanzada, subsidiarios de tratamiento con L-Dopa en infusión continua duodenal” a cargo del Dr. José A. Molina).
RESULTADOS OBTENIDOS HASTA EL MOMENTO.

En el presente proyecto, dirigido por la Dra. Ana Isabel Flores de la Cal y en colaboración con el Dr. José Antonio Molina ya se han obtenido diversos resultados. Por un lado, se han obtenido muestras gástricas de pacientes de Parkinson sometidos a una duodenostomía para recibir el tratamiento de Duodopa®, así como de individuos sanos que se han empleado como controles. En las muestras se ha analizado la presencia o ausencia de la proteína alfa-sinucleína. Los resultados han mostrado la presencia de sinucleína en la mucosa gástrica de la gran mayoría de los pacientes de Parkinson y su ausencia en los individuos sanos [22]. Esto sugiere que en la enfermedad de Parkinson es posible encontrar alteraciones fuera del sistema nervioso central y cuyo significado fisiopatológico está aún sin clarificar.


Por otro lado, se ha obtenido tejido cerebral del Banco de Tejidos de la Fundación CIEN (BT-CIEN, Fundación Centro de Investigación de Enfermedades Neurológicas). En una primera aproximación se ha evaluado la estructura de la proteína alfa-sinucleína presente en el cerebro de los enfermos de Parkinson y se ha comparado con la de los sujetos sanos. Los resultados indican la presencia de dos formas de la proteína en los enfermos de Parkinson, una alfa-sinucleína normal o soluble y una alfa-sinucleína mal plegada o insoluble y que es la estructura patológica. Sin embargo, en el cerebro de los sujetos sanos no se observa la presencia de la proteína mal plegada o insoluble.

Además, en el laboratorio se han obtenido y/o cultivado células de neuroblastoma, células madre de placenta humana, y neuronas obtenidas por diferenciación de las células madre de placenta. Mediante técnicas de inmunofluorescencia, así como de western blot, empleando anticuerpos específicos que detectan la proteína total, se ha comprobado que las células de neuroblastoma tienen la proteína alfa-sinucleína en cantidades fácilmente detectables, mientras que dicha proteína está presente aunque es menos abundante en las células madre de placenta y en las neuronas diferenciadas de ellas. La presencia de la proteína alfa-sinucleína tanto en células de neuroblastoma, como en células madre de placenta y en las neuronas obtenidas a partir de la diferenciación de las células de placenta nos pueden servir como modelos de estudio de la fisiopatología de la enfermedad y de su trasmisión célula a célula.


HIPÓTESIS PARA LA CONTINUACIÓN DEL PROYECTO.

Ya hemos demostrado la presencia de alfa-sinucleína a nivel de la submucosa gástrica en pacientes de Parkinson.

Nuestro grupo de Medicina Regenerativa del Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre (i + 12) ha aislado y caracterizado unas células de tipo mesenquimal de la placenta humana con gran capacidad regenerativa y de inmunoprotección.

El presente proyecto pretende estudiar si la alfa-sinucleina presente por un lado, en el cerebro de los enfermos de Parkinson, y por otro, en las muestras gástricas de dichos pacientes es capaz de actuar como un factor priónico capaz de infectar las células madre mesenquimales de placenta sin diferenciar, células neurales obtenidas mediante diferenciación de las células madre mesenquimales de placenta, y compararlo con el efecto obtenido sobre una línea de células neurales en cultivo.


OBJETIVOS:

1. Para la puesta a punto de las técnicas y de la corroboración de nuestra hipóteis, incialmente se empleará una proteína alfa-sinucleína recombinante que se va a fibrilar en el laboratorio con el fin de obtener una alfa-sinucleína mal plegada y que sea semejante a la encontrada en el cerebro de los enfermos de Parkinson. Las tres líneas celulares anteriormente descritas se cultivarán con esta alfa-sinucleína mal plegada. Con esto se pretende ver si en las células se observa la aparición de alfa-sinucleína mal plegada y/o agreagada. De ser así, dispondríamos de un modelo fácil y reproducible en el laboratorio de “transmisión” de la proteína patológica y que nos permitiría el estudio de este proceso y el ensayo de fármacos. En este objetivo se pretende además estudiar si existen alteraciones en el funcionamiento celular. En este sentido se va a analizar si se produce una alteración de la función mitocondrial y/o si se detecta el aumento de radicales libres que puedan inducir la muerte celular. En el caso de que alguno de los tipos celulares no presentara esta forma patológica de la proteína podría sugerir que esas células poseen mecanismos de protección que sería importante investigar.


2. Se realizarán estudios semejantes a los descritos en el punto 1, pero usando como fuente de alfa-sinucleína mal plegada las muestras de tejido de cerebros de pacientes con Parkinson y/o de muestras de la mucosa gástrica de dichos pacientes.
PERIODO DE DURACIÓN: 1-2 años
REFERENCIAS.

1. Braak, H., et al., Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neurosci Lett, 2006. 396(1): p. 67-72.

2. Spillantini, M.G., et al., Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature, 1997. 388(6645): p. 839-40.

3. Jakes, R., M.G. Spillantini, and M. Goedert, Identification of two distinct synucleins from human brain. FEBS Lett, 1994. 345(1): p. 27-32.

4. Norris, E.H., B.I. Giasson, and V.M. Lee, Alpha-synuclein: normal function and role in neurodegenerative diseases. Curr Top Dev Biol, 2004. 60: p. 17-54.

5. Polymeropoulos, M.H., et al., Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science, 1997. 276(5321): p. 2045-7.

6. Kordower, J.H., et al., Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med, 2008. 14(5): p. 504-6.

7. Li, J.Y., et al., Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med, 2008. 14(5): p. 501-3.

8. Li, J.Y., et al., Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease. Mov Disord, 2010. 25(8): p. 1091-6.

9. Angot, E., et al., Are synucleinopathies prion-like disorders? Lancet Neurol, 2010. 9(11): p. 1128-38.

10. Brundin, P., R. Melki, and R. Kopito, Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010. 11(4): p. 301-7.

11. Borghi, R., et al., Full length alpha-synuclein is present in cerebrospinal fluid from Parkinson's disease and normal subjects. Neurosci Lett, 2000. 287(1): p. 65-7.

12. Lee, H.J., S. Patel, and S.J. Lee, Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J Neurosci, 2005. 25(25): p. 6016-24.

13. Pfeiffer, R.F., Gastrointestinal dysfunction in Parkinson's disease. Lancet Neurol, 2003. 2(2): p. 107-16.

14. Qualman, S.J., et al., Esophageal Lewy bodies associated with ganglion cell loss in achalasia. Similarity to Parkinson's disease. Gastroenterology, 1984. 87(4): p. 848-56.

15. Kupsky, W.J., et al., Parkinson's disease and megacolon: concentric hyaline inclusions (Lewy bodies) in enteric ganglion cells. Neurology, 1987. 37(7): p. 1253-5.

16. Wakabayashi, K., et al., Parkinson's disease: the presence of Lewy bodies in Auerbach's and Meissner's plexuses. Acta Neuropathol, 1988. 76(3): p. 217-221.

17. Wakabayashi, K., et al., Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system. Acta Neuropathol, 1990. 79(6): p. 581-3.

18. Braak, H. and K. Del Tredici, Invited Article: Nervous system pathology in sporadic Parkinson disease. Neurology, 2008. 70(20): p. 1916-25.

19. Savidge, T.C., M.V. Sofroniew, and M. Neunlist, Starring roles for astroglia in barrier pathologies of gut and brain. Lab Invest, 2007. 87(8): p. 731-6.

20. Gill, S.R., et al., Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science, 2006. 312(5778): p. 1355-9.

21. Turnbaugh, P.J., et al., The effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice. Sci Transl Med, 2009. 1(6): p. 6ra14.



22. Sánchez-Ferro, A. et al., In vivo gastric detection of α-synuclein inclusions in Parkinson's disease. Mov Disord. 2014 Aug 11. doi: 10.1002/mds.25988




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