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ANEXOS


Anexo 1

Fotografía Salmón coho adulto


Anexo 2

Datos recopilados por Hoffman y Hamm (1978)



Distribución de los Grupos Sulfhidrilos y Sulfuros

en las principales proteínas miofibrilares
















Proteína

mg SH / 100 g total proteína miofibrilar

%

mg SS / 100 g total proteína miofibrilar

%

Miosina

156

65

-

-

Actina

70

29

-

-

Tropomiosina

3

1

12

48

Troponina

10

4

11

52


Anexo 3

Datos recopilados por Hoffman y Hamm (1978)




Estimación de los Grupos SH en miofibrillas










Reactivo SH

Valores SH originales

Moles SH / 10E5 g proteínas

AgNO3

85-90 µmoles / g proteína

8,5-9,0

AgNO3

3,14 mg / g proteína

9,5

AgNO3

2,59-4,27 mg / g proteína

7,8-12,9

NEM

1,16-1,31 mg/ g proteína

3,5-4,0

NEM

2,95-3,21 mg / g proteína

8,9-9,7

PCMB

5,4 moles / 105 g proteína

5,4

PCMB

3,06-3,09 mg / g proteína

9,2-9,3

DTNB

0,59 µmoles / mg N

9,4

DTNB

3,0-3,9 moles / 105 g proteína

3,0-3,9

DTNB

8,6-9,6 moles / 105 g proteína

8,6-9,6

DTNB

60-65 µmoles / g proteína

6,0-6,5

DTNB

85-90 µmoles / g proteína

8,5-9,0

CH3HgNO3

8,8 moles / 105 g proteína

8,8

o-acido iodobenzoico

2,75-4,32 mg / g proteína

8,3-13,1



Anexo 4

Materiales, Equipos y Métodos
Materias Primas

Salmón Coho tipo HG congelado a -18 ºC.


Reactivos Químicos Análisis Sulfhidrilos y Sulfuros con sus Proteínas

  • Urea 8M en amortiguador Tris-Gli- EDTA pH 8 (trizma base, glicina y EDTA).

  • Urea 10M en amortiguador Tris-Gli- EDTA pH 8 (trizma base, glicina y EDTA).

  • Reactivo de Ellman´s 0,01M pH 7 (5,5´-Dithiobis (2-nitrobeznoicacid))

  • 2-mercaptoetanol

  • TCA 24% (Ácido Tricloroacético)

  • TCA 12% (Ácido Tricloroacético)

  • SDS 0,2 % p/v



Reactivos Químicos Análisis Carbonilos y sus Proteínas

  • Buffer Homogenizado, el cual contiene 50 nM de buffer fosfato, pH 7.4, 0,1 % digitonina, un cóctel de antiproteasas (40 µg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 µg/ml leupeptin, 7 µg/ml pepstatin, y 5 µg/ml aprotonin) y 1 nM EDTA.

  • Solución 10 % p/p de Streptomycin sulfate en 50 nM de buffer fosfato.

  • Solución HCl 2,5 M.

  • 10 nM de 2,4-Dinitrofenilhydrazina en 2,5 M HCl.

  • Solución al 20 % de TCA (ácido tricloroacético)

  • Solución al 10 % de TCA (ácido tricloroacético)

  • Solución de etanol absoluto/ etilo acetato (1:1) (v/v)

  • Solución 6M de Guanidine hydrochloride que contiene 20 nM de fosfato de potasio ajustado a pH 2,3 con HCl concentrado.


Equipos Método Sulfhidrilos y Sulfuros

  • Baño termoregulado Heidolph WB 2000.

  • Balanza analítica EK- 120 A MFD by A&D Co., ltd ser: C 0116002 made in Japan.

  • Centrífuga Sorvall super speed RC 2-B ser: 66200, Norwalk, Conn, U.S.A.

  • Congelador Whirpool no frost -60ºC.

  • Espectrofotómetro Perkin Elmer UV / VIS Lambdall D-88647 made in Germany.

  • Refrigerador marca Bosch -18ºC.



Equipos Método Carbonilos

  • Baño termoregulado Heidolph WB 2000.

  • Balanza analítica EK- 120 A MFD by A&D Co., ltd ser: C 0116002 made in Japan.

  • Centrífuga Sorvall super speed RC 2-B ser: 66200, Norwalk, Conn, U.S.A.

  • Congelador Whirpool no frost -60ºC.

  • Espectrofotómetro Perkin Elmer UV / VIS Lambdall D-88647 made in Germany.

  • Refrigerador marca Bosch -18ºC.

Otros Equipos y Materiales

  • Material de plástico (bandejas, fuentes, recipientes, piscetas, tubos de centrífuga).

  • Material de vidrio (vasos precipitados, matraces aforados y Erlenmeyer, probetas graduadas, embudos, pipetas graduadas y volumétricas, tubos de ensayo y varilla de vidrio.

  • Material de acero inoxidable (ollas, cuchillos).

  • Micropipetas p1000, p250.

  • Toalla nova.

  • Hielo.


Método Sulfhidrilos

Hardham H (1981) “The determination of total and reactive sulhydryl of whey protein concentrates. Aust J. Diary Technol. 36
A diferencia del método descrito por Beveridge et al., 1974 y modificada por Hardham en 1981, se hicieron variaciones debido a los valores obtenidos de sulfhidrilos, el procedimiento realizado es el que se detalla a continuación.


  • Se cortan 0,25 gramos aproximados del tejido del salmón finamente pero sin romper la estructura, llevado del congelador al refrigerador 24 horas previas al análisis.

  • En un tubo de centrífuga se colocan los 0,25 gramos de músculo y se agregan 10 mL. de urea 8M en buffer Tris-Gli-EDTA.

  • Centrifugar a 5.090 g por 5 minutos.

  • Para la cuantificación de proteínas se toman 1,5 ml del extracto y se agregan a 1,5 mL. de SDS 0,2% p/v preparado previamente en un tubo de ensayo y homogenizar.

  • También tener un tubo de ensayo con 3 mL SDS 0,2% p/v y otro con 1,5 mL de SDS 0,2% p/v con 1,5 mL de buffer urea 8 M.

  • Leer en estos tubos la absorbancia a 280 y 260 nM. en espectrofotómetro. El tubo con SDS solo debe tener absorbancia cercana a 0.

  • Del sobrenadante obtenido de la centrifugación se toman 3 mL. y se agregan a un tubo de ensayo con 0,05 mL. de reactivo de Ellman´s, en otro tubo se agregan 3 mL. del sobrenadante y en otro tubo previamente preparado se colocan 3 mL. de buffer úrea 8 M con 0,05 mL de reactivo de Ellman´s.

  • Homogenizar y esperar 30 minutos a temperatura ambiente agitando de vez en cuando y medir la absorbancia de estos tres tubos a 412 nM. en espectrofotómetro.

Los cambios realizados en el método se debieron que la medición en espectrofotómetro era superior a lo señalado por la ley de Beer (entre 0,2 y 1 de absorbancia), debido a esto se redujo la cantidad de muestra indicada en el método de la siguiente forma: 1 gramos de carne ►►0,25 gramos de carne.


Para la cuantificación de proteínas se procedió a diluir la muestra con SDS 0,2% p/v para poder cumplir nuevamente con la ley de Beer y minimizar las interacciones que se pudieran producir entre proteínas y ácidos nucleicos.

El buffer Tris-Gli-EDTA se preparó previamente pesando 1,489 gramos de EDTA, 10,418 gramos de Tris-HCl , 6,752 gramos de Glicina, se agregan 400 mL de agua destilada luego se va agregando lentamente 480,48 gramos de urea con calentamiento, de ser necesario se agrega mas agua pero no sobre 900 ml. luego se ajusta a pH.8 con HCl o NaOH de ser necesario y se afora a 1litro nuevamente con agua destilada.

La solución de SDS 0,2 % p/v se prepara pesando 2 gramos de SDS y se afora a 1 litro con agua destilada.

El reactivo de Ellman´s se prepara pesando 3,96 gramos de ácido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico se agrega un poco de etanol y se ajusta a pH.7, luego se afora a 1litro con etanol.




Método Sulfuros

Hardham H (1981) “The determination of total and reactive sulhydryl of whey protein concentrates. Aust J. Diary Technol. 36
A diferencia del método descrito por Beveridge et al., 1974 y modificada por Hardham en 1981, se hicieron variaciones debido a los valores obtenidos de sulfhidrilos, el procedimiento realizado es el que se detalla a continuación.


  • Se corta 80 miligramos aproximado del tejido del salmón finamente pero sin romper la estructura, llevado del congelador al refrigerador 24 horas previas al análisis.

  • En un tubo de centrífuga se colocan los 80 miligramos de músculo y se agregan 5 mL. de urea 10 M en buffer Tris-Gli-Edta. y 0,1 mL de 2-mercaptoetanol, se homogeniza y se deja reposar 1 hora a temperatura ambiente en campana cerrada.

  • Posteriormente se adicionan 2,5 mL. de TCA 24%, se homogeniza y nuevamente se deja reposar por 1 hora.

  • Posteriormente centrifugar a 5,090 g por 10 minutos y eliminar el sobrenadante.

  • Adicionar 2,5 mL. de TCA 12% al precipitado y se deja reposar por 30 minutos, se centrifuga a 5,090 g por 10 minutos y se elimina el sobrenadante.

  • Se repite esta última operación nuevamente y se elimina sobrenadante.

  • Luego al precipitado se agregan 10 mL de urea 8M en buffer Tris-Gli-Edta., se rompe el precipitado con una varilla de vidrio y se coloca el tubo en un baño termoregulado por 25 minutos a 60 ºC.

  • Centrifugar 5 minutos a 5,090 g, tomar 2,25 ml del sobrenadante para determinación de proteínas, se agregan 0,75 mL. de SDS 0,2 % p/v. En otro tubo preparado previamente se tiene 3 mL. de SDS y en otro tubo 0,75 mL. de SDS con 2,25 mL. de buffer úrea 8M. Esperar 10 minutos y leer estos tubos a 280 260 nM.en espectrofotómetro.

  • Del sobrenadante obtenido de la centrifugación se toman 3 mL. y se agregan a un tubo de ensayo con 0,05 mL. de reactivo de Ellman´s, en otro tubo se agregan 3 mL. del sobrenadante y en otro tubo previamente preparado se colocan 3 mL. de buffer urea 8 M con 0,05 mL de reactivo de Ellman´s.

  • Homogenizar y esperar 30 minutos a temperatura ambiente agitando de vez en cuando y medir la absorbancia de estos tres tubos a 412 nM. en espectrofotómetro

Los cambios realizados en el método se debieron que la medición en espectrofotómetro era superior a lo señalado por la ley de Beer (entre 0,2 y 1 de absorbancia), debido a esto se redujo la cantidad de muestra indicada en el método de la siguiente forma: 1 gramos de carne ►►80 miligramos de carne.


Para la cuantificación de proteínas se procedió a diluir la muestra con SDS 0,2% p/v para poder cumplir nuevamente con la ley de Beer y minimizar las interacciones que se pudieran producir entre proteínas y ácidos nucleicos.

El buffer Tris-Gli-EDTA se preparó previamente pesando 1,489 gramos de EDTA, 10,418 gramos de Tris-HCl , 6,752 gramos de Glicina, se agregan 400 mL de agua destilada luego se va agregando lentamente 600,6 gramos de urea con calentamiento, de ser necesario se agrega mas agua pero no sobre 900 ml. luego se ajusta a pH.8 con HCl o NaOH de ser necesario y se afora a 1litro nuevamente con agua destilada.

La solución de SDS 0,2 % p/v se prepara pesando 2 gramos de SDS y se afora a 1 litro con agua destilada.

El reactivo de Ellman´s se prepara pesando 3,96 gramos de ácido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico se agrega un poco de etanol y se ajusta a pH.7, luego se afora a 1litro con etanol.

La solución de TCA al 24 % se prepara pesando 240 g de ácido tricloroacético y aforar a 1 litro con agua destilada.

La solución de TCA al 12 % se prepara pesando 120g de ácido tricloroacético y aforar a 1 litro con agua destilada.


Determinación de la cantidad de proteína soluble

Métodos SH y SS

Hardham H (1981) “The determination of total and reactive sulhydryl of whey protein concentrates. Aust J. Diary Technol. 36
La determinación de la proteína en el extracto fue realizada utilizando el procedimiento de densidad óptica a 280 nm. El principio de esta determinación esta basado en asumir que si una solución nos entrega un valor de absorbancia de 1, esto significa que la concentración de proteína es de 1mg/ml. Hoffman y Hamm (1978)

Para determinar los mg de proteína soluble/ gramos de músculo se procedió a dividir la absorbancia medida a 280 nm. con la absorbancia medida a 260 nm. con el valor obtenido se procedió a interpolar en la tabla del anexo 14 , este es un factor de corrección, luego a la absorbancia obtenida a 280 nm. se le resta la absorbancia obtenida del tubo de ensayo de SDS con buffer de extracción. A este número obtenido se multiplica por el factor de corrección obtenido de la tabla y por el factor de dilución que en el caso de sulfhidrilos fue de 20 y de 13,3 en sulfuros el número obtenido es el valor de mg de proteínas solubles/g de músculo.




Método Carbonilos

Reaznick y Parker (1994) “Oxidative damage to proteins. Spectrophotometric method for carbonyl assay” Methods in enzymology: 233


  • Se corta 100 miligramos aproximado del tejido del salmón finamente pero sin romper la estructura, llevado del congelador al refrigerador 24 horas previas al análisis.

  • En un tubo de centrífuga se colocan los 100 miligramos de músculo y se agregan 3 mL. de buffer refrigerado y se deja reposar 15 minutos a temperatura ambiente.

  • Luego centrifugar por 10 minutos a 6000 g y leer este sobrenadante en espectrofotómetro a 280 y 260 nM. Si la relación 280/260 es menor que 1 se debe realizar el paso a continuación, debido a la concentración de ácidos nucleicos de la muestra este paso siempre se realiza.

  • Agregar 0,3 mL de la solución de sulfato de streptomicina al 10% hasta alcanzar la concentración del 1%, esperar 15 minutos y centrifugar por 10 minutos a 6,000 g, del sobrenadante tomar 2 muestras de 1 mL. cada una. Son colocadas en tubos de ensayo de 12 mL. de vidrio. Un tubo contiene 4 mL. de 10 nM DNPH en HCl 2,5 M, y el otro tubo contiene solamente 4 mL. de HCL 2,5 M. los tubos son dejados por 1 hora para incubación a temperatura ambiente, de preferencia en la oscuridad, y agitar cada 15 minutos.

  • Posteriormente traspasar a tubos de centrifuga y agregar 5 ml de TCA 20% a ambos tubos, asegurándose de arrastrar todo el contendido de los tubos de vidrio a los tubos de centrífuga. Se colocan los tubos en una cubeta plástica con hielo por 10 minutos, procediendo después a centrifugar por 5 minutos a 6000 g, el sobranadante es eliminado, luego se agregan 4 mL de TCA 10% se rompe el precipitado con una varilla de vidrio esperar 5 minutos y centrifugar a 6000 g por 5 minutos, nuevamente se elimina el sobrenadante, se realiza otro lavado, esta vez con 4 mL. de Etanol-etilo acetato (1:1) (v/v) se realiza 3 veces, hasta desaparición de color en la solución.

  • El precipitado final es disuelto en 2 mL. guanidine hydrochloride 6M, con una varilla de vidrio se rompe el precipitado y se deja por 10 minutos a 50 ºC en un baño termoregulado, los últimos 2 minutos con agitación, luego leer en espectrofotómetro a 280, 355 y 390 nM. Los 2 tubos.

Los cambios realizados fueron 150-200 miligramos de carne ►►100 miligramos de carne para poder obtener valores que permitieran su cuantificación en el espectrofotómetro, en hielo fueron dejadas las muestras 15 minutos no 10 para asegurarse de la completa precipitación de los grupos obtenidos, el baño termoregulado se utilizó a 50 ºC en vez de 37 debido a la temperatura que tenia la muestra era baja y así asegurarse de la completa solubilización del los compuestos obtenidos.

Para la preparación del buffer refrigerado se peso 0,1 gramo de digitonina,;0,04 gramos de PMSF; 0,005 gramos de leupeptina; 0,007 gramos de pepstatina; 0,005 gramos de aprotonina; 0,372 gramos de EDTA,

Adicionalmente se prepara una solución de buffer fosfato pesando 10,65 gramos de Na2HPO4 y 3 gramos de NaH2PO4 y aforando a 100 ml con agua destilada, de esta solución se toman 50 ml y se agregan al buffer refrigerado, luego aforar el buffer refrigerado a 1 litro con agua destilada.

La estreptomicina se prepara pesando 10 gramos de la sal, se agregan 5 ml del buffer fosfato preparado previamente y se agregan 95 ml de agua destilada.

La solución de TCA al 20 % se prepara pesando 200 gramos de TCA y aforando a 1 litro con agua destilada.

La solución de TCA al 10 % se prepara pesando 100 gramos de TCA y aforando a 1 litro con agua destilada.

La solución de etilo-acetato/etanol 1:1 (v/v) se prepara midiendo 500 ml de etilo-acetato y se agregan 500 ml de etanol.

La solución de guanidinio 6M. se prepara pesando 573,18 gramos de guanidino, con 2,72 gramos de KH2PO4, se agrega un poco de agua destilada se ajusta a pH2.3 con HCl concentrado y se afora a 1 litro con agua destilada.

La solución de DNPH se prepara pesando 1,98 g de DNFH y se agrega 1 litro de HCl 2,5 M.

La solución de HCL 2,5 M se prepara utilizando 80 mL de una solución de HCl concentrado de densidad 1,18 kg/L y aforando a 1 litro con agua destilada.

Determinación de la cantidad de proteína soluble

Método carbonilo

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