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Octavio alexis aravena madariaga


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Universidad de Chile

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular


Memoria para optar al título de Bioquímico


CÉLULAS DENDRÍTICAS INDUCTORAS DE UNA RESPUESTA TOLEROGENICA


OCTAVIO ALEXIS ARAVENA MADARIAGA

Profesor Guía: Profesor Patrocinante:

Dr.Juan Carlos Aguillón Dr. Javier Puente Piccardo.

Programa Disciplinario de Inmunologìa Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Facultad de Medicina Facultad de Cs. Químicas y Farmacéuticas

Universidad de Chile Universidad de Chile


Santiago Chile

2006

ÍNDICE

Página


íNDICE DE FIGURAS 3

ABREVIATURAS 11



1 RESUMEN 12

2 SUMMARY 14

3 INTRODUCCIÓN 16

4 HIPÓTESIS. 28

5 OBJETIVO GENERAL 28

6 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 29

7 MATERIALES Y MÉTODOS 30

8 RESULTADOS 35

2 C 41

1 A 41

9 DISCUSIÓN 61

10 CONCLUSIONES 71

11 BIBLIOGRAFÍA 73


íNDICE DE FIGURAS


Figura 1: Células precursoras de médula ósea en cultivo fueron tomadas y fijadas para ser analizadas por citometría de flujo. Los dot-plot obtenidos representan en el eje de las ordenadas la granuralidad o complejidad celular (SSC) y en el eje de las abscisas el tamaño (FSC) celular. En A, se muestra células al día 0 de cultivo, en B, al día 3, en C al día 5, en D, al día 7, en E, al día 9 y F al día 11 de cultivo. Figura representativa de 3 experimentos independientes. 36

Figura 2: Gráficos Dot-Plot BMDC al día 7 de cultivo obtenidos por citometría de flujo. La población celular seleccionada por tamaño y granularidad en la región R1 (A) se utilizó para cuantificar el porcentaje de DCs en el cultivo, células sin tinción (B), y con tinción para CD11c (C) fueron analizadas, observándose aproximadamente 60% de células con este marcador. La fluorescencia media (MFI) asociada al marcador CD11c fue observada en un histograma, sin tinción (línea oscura sin relleno) y con tinción (en gris) (D). Figura representativa de 3 experimentos independientes. 41

Figura 3: Expresión de CD11c. BMDC fueron teñidas y fijadas al día 7 de cultivo para determinar la expresión de CD11c por citometría de flujo. En la gráfica se observan sólo diferencias significativas en la expresión de CD11c para BMDC expuestas a TNFα por 24 horas (**p <0.01) y TNFα por 48 horas (*p <0.05) en comparación a BMDC sin tratamiento. Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 42

Figura 4: Expresión de CD11c, MHC I, CD40 y CD86, representado en histogramas. BMDC sin tratamiento o expuestas a diferentes estímulos como; IL-10 por 24 y 48 horas, IL-10 por 48 y LPS por 24 horas, TNFα por 24 y 48 horas y LPS por 4 y 24 horas, de arriba abajo respectivamente, BMDC fueron teñidas y fijadas al día 7 de cultivo para determinar la expresión de estas moléculas por citometría de flujo. La intensidad media de fluorescencia (MFI) asociada a cada estímulo fue obtenida para cada uno de las moléculas de superficie. Figura representativa de 3 experimentos independientes. 44

Figura 5: Expresión de MHC I. BMDC fueron teñidas y fijadas al día 7 de cultivo, para determinar la expresión de MHC I por citometría de flujo. Se representa la MFI asociada a la expresión de MHC I al ser expuestas a diferentes estímulos, siendo estas diferencias significativas (**p < 0.01) para BMDC estimuladas con LPS por 24 horas y BMDC pre-tratadas con IL-10 y posteriormente estimuladas con LPS (***p<0.001), comparadas a BMDC sin estimular. Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 45

Figura 6: Expresión de CD40. BMDC fueron teñidas y fijadas al día 7 de cultivo para determinar la expresión de CD40 por citometría de flujo. Las BMDC fueron expuestas a diferentes estímulos, siendo estas diferencias significativas (***p<0.001) para BMDC estimuladas con LPS por 24 horas con y sin pre tratamiento con IL-10 y BMDC tratadas con LPS por 4 horas (*p<0.05), comparadas con BMDC sin estimular. Para los otros estímulos no se obtuvieron diferencias significativas (p> 0.05). Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 47

Figura 7: Expresión de CD86. BMDC fueron teñidas y fijadas al día 7 de cultivo para determinar la expresión de CD86 por citometría de flujo. Se grafica la MFI asociada a cada uno de los estímulos a los cuales fueron sometidas las BMDC, no se observan diferencias significativas (p>0.05) en ninguno de los estímulos comparadas con células sin estímulo. Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 48

Figura 8: Expresión de CD54 (ICAM). BMDC fueron teñidas y fijadas al día 7 de cultivo para determinar la expresión de CD54 por citometría de flujo. El gráfico representa la MFI asociada a cada uno de los estímulos a los cuales fueron sometidas BMDC, observándose diferencias significativas para BMDC tratadas con LPS por 4 y 24 horas (***p<0.01) comparadas con células sin tratamiento. Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 49

Figura 9: Expresión CCR7. BMDC fueron teñidas y fijadas al día 7 de cultivo para determinar la expresión de CCR7 por citometría de flujo. En el gráfico se representa la MFI asociada a cada uno de los estímulos. No se observan diferencias significativas (p> 0.05) entre ninguno de los estímulos, comparas a BMDC S/T. Se observaron diferencias para BMDC tratadas con LPS 4 horas comparadas a BMDC tratadas con IL-10 (*p<0.05). Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 50

Figura 10: Expresión de CD45RB. BMDC fueron teñidas y fijadas al día 7 de cultivo para determinar la expresión de CD45RB por citometría de flujo.. En el gráfico se representa la MFI asociada a BMDC tratada con diferentes estímulos. Se observaron diferencias significativas para BMDC tratadas con LPS por 24 horas (***p< 0.001) comparadas con células sin tratamiento. Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 51

Figura 11: Capacidad endocítica. BMDC fueron incubadas con Dx-FITC por 4 horas a 37ºC y fijadas para determinar la capacidad endocítica por citometría de flujo Se observa una disminución de la endocitosis para BMDC estimuladas con TNFα 48 horas, LPS 4 y 24 horas (***p< 0.001), en cambio IL-10 y TNFα 24 horas no fueron capaces de alterar esta propiedad de las BMDC sin tratamiento (p> 0.05).Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 55

Figura 12: Secreción de IL-12p70 por BMDC tratadas con diferentes estímulos de maduración. BMDC tratadas con TNFα 48 horas, LPS por 4 y 24 horas secretan una mayor cantidad de esta citoquina en comparación a BMDC sin tratamiento (***p< 0.001). Los otros estímulos como IL-10 por 24 y 48 horas y TNFα por 24 horas secretan niveles similares p (>0.05) a BMDC sin tratamiento. La cuantificación se realizó por ELISA de captura utilizando anticuerpos específicos tanto para la captura como para el revelado. Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 56

Figura 13: Secreción de IL-10 por BMDC tratadas con diferentes estímulos de maduración. Tanto las BMDC tratadas con IL-10 por 48 horas (***p<0.001), tratadas con TNFα por 48 horas (***p < 0.01), y (tratadas con LPS por 4 horas (*p< 0.05), secretaron altos niveles se esta citoquina, en cambio no se observaron diferencias significativas con el resto de los estímulos comparadas con BMDC sin tratamiento. La cuantificación se realizó por ELISA de captura utilizando anticuerpos específicos tanto para la captura como para el revelado. Datos son representados como promedio de tres muestras con sus desviaciones estándar correspondientes. 58

Figura 14: Evolución de la artritis murina Inducida por colágeno (CIA) en respuesta al tratamiento con BMDC estimuladas con LPS por 4 horas. En A se observa la gráfica del Edema de cada uno de los grupos de animales y en B el Índice Artrítico. El grupo de animales tratados con BMDC estimuladas con LPS por 4 horas y cargadas con CII (○) mostró una mejoría dada por la disminución del Edema y el Índice Artrítico en comparación al grupo control CIA (■) y el grupo tratados con BMDC estimuladas con LPS por 4 horas pero sin CII (∆). 60


Acm Anticuerpo monoclonal

Ag Antígeno

AR Artritis reumatoide

BMDC Células dendríticas derivadas de médula ósea

CD11c Integrina x

CD40 Proteína integral de membrana ligando para CD40L

CD86 molécula coestimulatoria B7-2 ligando para CD28

CIA Artritis inducida por colágeno

CII Colágeno bovino tipo II

Dx-FITC Dextran conjugado a ficoeritrina

FITC Isocianato de ficoeritrina

FSC Tamaño

GM-CSF Factor estimulante de colonias monocíticas y macrofágicas

IFN Interferón gamma

IL-12 Interleuquina 12

IL-10 Interleuquina 10

IL-4 Interleuquina 4

LPS Lipopolisacárido

MFI Intensidad media de fluorescencia

MHC Molécula del complejo mayor de histocompatibilidad

PE Ficoeritrina

SSC Granularidad

Th Linfocitos T helper

Tr Linfocitos T reguladores

TLR Receptor tipo toll

TNF factor de necrosis tumoral alfa

VIP Péptido intestinal vasoactivo
ABREVIATURAS

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