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Desarrollo de un tomografo por emision de positrones experimental para el estudio del sistema nervioso en animales


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DESARROLLO DE UN TOMOGRAFO POR EMISION DE POSITRONES EXPERIMENTAL PARA EL ESTUDIO DEL SISTEMA NERVIOSO EN ANIMALES
1. ANTECEDENTES
En la actualidad no existe un método que nos permita visualizar de manera directa la actividad de los circuitos neuronales durante tareas motoras específicas. El presente proyecto esta dirigido a estudiar la localización tridimensional de las neuronas espinales que generan actividad eléctrica basal espontánea y de las neuronas espinales que participan en la locomoción ficticia en el gato. Una de sus líneas de enfoque requiere del desarrollo de un tomógrafo por emisión de positrones (PET) de alta resolución, accesible y versátil que no existe comercialmente y por consiguiente debe ser desarrollado ex profeso. El desarrollo propuesto de este PET se basa en avances tecnológicos recientes en la manufactura de cristales centelladores y de detectores de luz de alta resolución espacial y temporal que surgieron en el área de la física experimental de partículas elementales. El éxito de este proyecto depende de la colaboración cercana de varios investigadores con formación en diferentes disciplinas científicas. Cabe mencionar que este tipo de proyectos multidisciplinarios históricamente han jugado un papel crucial en el desarrollo de la ciencia y la tecnología.

1.1 ANTECEDENTES DEL PROBLEMA CIENTIFICO
Los antecedentes del problema científico se abordan en dos partes. En la primera parte se presenta un panorama general sobre los principales estudios enfocados a la localización y caracterización de los elementos neuronales del circuito generador del patrón de la locomoción (CPG). En la segunda parte se exponen los antecedentes relativos a la identificación funcional y la localización bidimensional de las neuronas que generan actividad eléctrica basal espontánea, cuya respuesta es modulada por estímulos sensoriales. Claramente ambas líneas de investigación requieren de la implementación de instrumentación de frontera como el PET propuesto para determinar con mayor precisión la localización tridimensional de las neuronas activas durante el estado de reposo (es decir, aquel estado en el que las neuronas exhiben una actividad eléctrica basal tipo ruidosa, pero con significado funcional) y durante eventos dinámicos, como la locomoción o el rascado.

1.1.1 LOCALIZACION DE NEURONAS ESPINALES QUE PARTICIPAN EN LA LOCOMOCION

Los estudios sobre los generadores espinales de la locomoción se remontan a 1911 cuando Graham Brown observó en el gato espinalizado y desaferentado contracciones rítmicas y alternadas de músculos flexores y extensores, similares a las que ocurrían durante la locomoción normal, y propuso que esta actividad estaba controlada por dos sistemas de neuronas (“half centres”), los cuales se inhibían recíprocamente. Varias décadas después, Jankowska et al. (1967) propusieron un circuito compatible con la hipótesis de los “half centres” al encontrar dos grupos de interneuronas inhibidas recíprocamente durante la locomoción ficticia inducida por L-DOPA (Jankowska et al. 1967). Se ha propuesto que las interneuronas activadas rítmicamente durante la locomoción ficticia forman parte de los circuitos generadores del patrón de la locomoción (CPG).

Hasta la fecha se considera que el CPG es un sistema compuesto de una serie de osciladores unitarios semi-autónomos distribuidos a lo largo de la médula espinal, los cuales pueden ser acoplados o desacoplados dinámicamente por vías supraespinales y propioespinales (Grillner y Wallen, 1985). Con las técnicas disponibles en la actualidad ha sido muy difícil medir directamente la actividad de poblaciones de neuronas en la médula espinal durante una conducta motora. Los abordajes empleados en la localización de poblaciones con actividad rítmica en la médula espinal de los mamíferos han sido realizados de manera indirecta, y en preparaciones reducidas de diferentes tipos (Kiehn y Kjaerulff 1998). En general, mediante estos abordajes se ha observado un marcaje difuso de neuronas activas (tanto interneuronas como motoneuronas) durante la locomoción o el rascado, principalmente en la parte medial y dorsolateral del núcleo intermedio (lámina VII), así como alrededor del canal central y en la lámina VIII.

Más recientemente, Yakovenko et al. (2001) desarrollaron un modelo dinámico para examinar la activación espaciotemporal en poblaciones de motoneuronas en la médula espinal del gato durante la locomoción ficticia. Para este propósito, los autores combinaron dos tipos de información: las coordenadas de 27 núcleos motores marcados retrógradamente con peroxidasa de rábano (Vanderhorst y Holtege, 1977) y los electromiogramas (EMGs) rectificados e integrados de los 27 músculos correspondientes, registrados durante la marcha real. Mediante este modelo fue posible simular la activación de los núcleos motores lumbosacros con el curso temporal de los EMGs correspondientes, y se revelaron algunos aspectos interesantes de la anatomía funcional de la médula espinal. Sin embargo, aunque la actividad de las motononeuronas refleja algunos aspectos de los generadores, en realidad este modelo no representa la actividad de los CPGs ya que los EMGs reflejan sólo la actividad supraumbral de las motoneronas.

Hasta la fecha no existe un método que permita visualizar tridimensionalmente de manera directa la actividad de los circuitos neuronales que se activan rítmicamente durante la locomoción. El uso de un tomógrafo por emisión de positrones de alta resolución espacial como el propuesto permitirá la medición directa y tridimensional de la actividad neuronal durante diversas tareas motoras ficticias, e investigar cómo se modulan o se reorganizan los generadores a nivel poblacional en presencia de “feed-back” sensorial. La estimulación de nervios musculares, cutáneos y articulares produce cambios en la amplitud y en la temporalidad del ciclo locomotor. Se podría examinar si a nivel poblacional se puede distinguir a la red generadora del ritmo, de la red intermedia (red de patrones o red seguidora) (Grillner y Zangger, 1984). Ambas redes pueden ser activadas selectivamente estimulando grupos de fibras aferentes específicas. Esta información ayudaría a despejar una incógnita crucial en la fisiología de la locomoción de los mamíferos, y permitiría comprobar si el modelo de los CPGs consiste de uno o dos niveles interneuronales (Rybak et al, 2004).

1.1.2 LOCALIZACIÓN DE NEURONAS ESPINALES QUE PRODUCEN ACTIVIDAD ELÉCTRICA BASAL
No solo durante la locomoción o el rascado las neuronas espinales están activas. También en condiciones de reposo las neuronas espinales exhiben una actividad eléctrica basal espontánea. De hecho, una de las características del sistema nervioso central (SNC) de los vertebrados es que presenta una actividad eléctrica basal que puede ser registrada con macro-electrodos colocados en la superficie del encéfalo o de la médula espinal. Las propiedades intrínsecas neuronales, los tipos de contactos sinápticos, los neuro-moduladores y la activación sincrónica neuronal intervienen en la amplitud y frecuencia de esta actividad eléctrica. Se sabe que dichas variaciones continuas del potencial eléctrico cefálico o espinal poseen una dinámica temporal en condiciones de vigilia muy diferente a la dinámica temporal durante el sueño o durante condiciones de anestesia. También se conoce que en animales anestesiados o en vigilia las respuestas de neuronas del SNC a estímulos eléctricos son variables y que hay una correlación estrecha entre la variabilidad de la amplitud de los potenciales eléctricos basales del SNC y las fluctuaciones en la amplitud de los potenciales eléctricos provocados por estímulos naturales a los receptores sensoriales visuales (Arieli y cols., 1996 ) y táctiles (Bindman y cols., 1964; Manjarrez y cols., 2000). En este contexto se ha propuesto que una función fisiológica de las neuronas del SNC que generan actividad eléctrica basal es la de modular las respuestas a estímulos sensoriales (Manjarrez y cols., 2000; 2002a,b; 2003b).

Recientemente se ha empleado la médula espinal del gato anestesiado como un modelo sencillo para estudiar la localización y función de las neuronas que generan actividad eléctrica basal (Manjarrez y cols., 2000; 2002a,b,c; 2003a). En particular, se ha demostrado que las neuronas que generan actividad eléctrica basal están localizadas en las láminas III a la VI del asta dorsal de la médula espinal, entre los segmentos lumbares L5 a L7 (Manjarrez y cols., 2000; 2003a). También, se ha reportado que la variabilidad de los reflejos monosinápticos está correlacionada con la variabilidad de la actividad eléctrica basal de las neuronas del asta dorsal (Manjarrez y cols., 2000). Estudios recientes (Vazquez y cols., 2004), en los que se han empleado registros con multielectrodos de superficie y análisis topográfico bidimensional, muestran que las neuronas del asta dorsal de la médula espinal se activan espontáneamente y dinámicamente en arreglos segregados. Es decir, las neuronas que generan actividad eléctrica basal en la médula espinal se organizan en grupos, los cuales podrían modular las respuestas a estímulos sensoriales o la amplitud de los reflejos monosinápticos. Una de las metas del presente proyecto es dilucidar cómo se organizan anatómicamente los grupos de neuronas espinales del asta dorsal que generan actividad eléctrica basal y determinar su localización espacial tridimensional con relación a la localización espacial de las neuronas activadas por estímulos sensoriales táctiles, térmicos, nociceptivos y por estímulos eléctricos a aferentes musculares que producen reflejos monosinápticos. El contar con un tomógrafo por emisión de positrones con una alta resolución espacial de 1.5 mm permitirá conocer la localización tridimensional de las neuronas espinales con actividad eléctrica basal y la localización de las neuronas que responden a estímulos sensoriales. Este conocimiento a su vez ayudaría a entender, desde un punto de vista de poblaciones, la compleja organización de las redes de neuronas con actividad eléctrica basal de la médula espinal.


1.2 ANTECEDENTES DE TOMOGRAFIA POR EMISION DE POSITRONES
La tomografía por emisión de positrones (PET) se ha convertido en los 30 años desde su invención en una herramienta básica de investigación en fisiología humana y animal ya que permite tomar imágenes funcionales in vivo de procesos biológicos. Este auge se debe por una parte al desarrollo de la tecnología nuclear que permite producir isótopos radioactivos de carbono, nitrógeno, oxígeno y flúor, entre otros, que emiten positrones con vidas medias cortas para obtener una amplia variedad de radio-fármacos, y por otra, a los desarrollos de nuevos cristales centelladores y de detectores de luz realizados por investigadores del medio académico con la meta de mejorar las técnicas de detección en física de partículas elementales.

Las imágenes de los PETs se basan en la detección de los dos fotones gama que resultan de la aniquilación del positrón emitido por el radio-fármaco con un electrón del medio bajo estudio. Estos dos fotones se emiten isotrópicamente en direcciones opuestas con una energía de 511 MeV cada uno. La detección en coincidencia de los dos fotones emitidos se hace mediante detectores de fotones gama situados diametralmente opuestos al objeto por lo que este método no requiere del uso de colimadores que son indispensables en otras técnicas de toma de imágenes médicas. Por esta razón la eficiencia de detección de los PETs es intrínsicamente mayor que la de los tomógrafos por emisión de un fotón individual (SPET). Las cámaras gama que se usan en la detección de los fotones normalmente se posicionan sobre un anillo que puede estar fijo o puede rotar alrededor de un eje. Las velocidades de detección de estos pares de fotones son típicamente de centenas de miles por segundo y los tiempos típicos de toma de imágenes son de centenas de segundos, de modo que el conjunto de decenas de millones de líneas rectas captadas permite obtener una imagen de la región enriquecida con el radio-fármaco a través de algoritmos de reconstrucción inversos (Shepp, L.A. et al., 1982; Lange K. et al.,1984).

El positrón emitido por el radio-fármaco es emitido con una energía cinética de centenas de KeV (242 KeV en el caso del Flúor 18) por lo que antes de aniquilarse con un electrón del medio viaja una distancia promedio de 1-2 mm conocida como rango de los positrones (1.4 mm en el caso de Flúor 18 en agua). Este efecto de rango degrada la resolución espacial de un PET en forma irreducible de modo que una imagen puntual se degrada a una esfera de 1 mm de diámetro. Otro efecto físico que también degrada la resolución espacial es el movimiento de los electrones del tejido al aniquilarse con los positrones emitidos por el radio-fármaco. La ley de conservación del momento lineal aplicada al sistema electrón-positrón en este caso implica que los dos fotones emitidos no viajan en direcciones exactamente opuestas sino que su ángulo difiere de 180° en alrededor de 0.5° (Humm J.L. et al. 2003). Otro efecto que contribuye a distorsionar las imágenes de los PETs es la dispersión de uno o ambos de los fotones gama en el mismo objeto de estudio ya que un fotón de 511 MeV tiene una trayectoria media de 10.4 cm en agua antes de interactuar y perderse por el efecto fotoeléctrico, contribuyendo a disminuir la estadística de pares de fotones; o podría interactuar y desviarse con una energía menor por dispersión de Compton, contribuyendo a crear líneas de respuesta erróneas en cuanto a que no pasan cerca del punto en que se aniquiló el par electrón-positrón. El efecto de las dispersiones Compton se puede reducir mediante la medición de las energías de los fotones gama y la eliminación de aquellos que presentan energías notablemente inferiores a 511 MeV.

Los fotones se detectan a través de la luz que producen en cristales centelladores. Esta eficiencia de detección debe ser alta para que exista un número alto de pares de fotones detectados en coincidencia. Esto se debe a que si la probabilidad de detectar un solo fotón gama es p, la probabilidad de detectar a los dos fotones gama emitidos será p2, por lo que p debe ser lo más alto posible. Esto implica a su vez que el medio de detección de los fotones gama debe poseer una sección eficaz de interacción alta para fotones gama de 511 MeV. Este requerimiento se traduce en que es indispensable que el medio detector tenga una densidad alta, , y un alto número atómico efectivo, Zef, ya que la sección eficaz de interacción por efecto fotoeléctrico es proporcional a Zef4. El medio detector que se usa comúnmente consiste en arreglos de cristales centelladores de 2x2x10 mm3 que producen luz de fluorescencia cuando el fotón gama interactúa fotoeléctricamente dentro de ellos; esta luz es detectada por fotomultiplicadores (PMTs) de multi-anodo de alta sensibilidad y alta velocidad que típicamente tienen pixeles de 2x2 mm2. Los cristales más comúnmente usados son centelladores inorgánicos tales como ioduro de sodio activado con talio (NaI:Tl), oxisilicato de lutecio activado con Cerio (Lu2SiO5:Ce) o Bi4Ge3O12, mejor conocido como BGO.

Los PETs para animales poseen la característica de ser pequeños y de permitir el monitoreo funcional de la concentración de un radio-fármaco en una pequeña región del organismo de un animal de laboratorio en forma repetitiva y no invasiva. Por esta razón, los principales obstáculos en el uso de PETs para estudios con animales de laboratorio han sido su baja resolución espacial aunada a su alto costo (Hume SP, Myers R., 2002). Por otro lado, los criterios de calidad de un PET para uso en animales como son su resolución espacial, eficiencia geométrica, eficiencia de detección y técnicas de corrección por dispersión interna no están tan estandarizados como en el caso de PETs para uso en humanos. Esto ha contribuido a una proliferación de equipos que no satisfacen las necesidades específicas para la aplicación efectiva de las técnicas PET en animales. La resolución espacial típica de los PETs para animales disponibles comercialmente es de 2 mm (Weber S. and Bauer A., 2004). El problema de la baja resolución en PETs para animales está ligado al menor diámetro del anillo donde se posicionan las cámaras gama, con lo que se incrementa la probabilidad de que el fotón gama penetre por la cara frontal de un cristal centellador pero interactúe en un cristal vecino, conduciendo a una línea de detección errónea. Este problema, conocido como profundidad de la interacción (DOI) se incrementa a medida que la longitud de los cristales centelladores se aumenta para aumentar la probabilidad de detección de los fotones gama. En general los PETs comerciales para animales tienen la deficiencia de no permitir correcciones al problema DOI mientras que el PET de alta resolución propuesto permitirá tal corrección a través del uso de una combinación en serie de dos tipos de cristales centelladores con diferente luminosidad por unidad de energía absorbida, por ejemplo, el LuAP emite 11400 fotones por MeV mientras que el LSO emite 27000, de modo que al digitalizar el pulso del detector de luz asociado con los cristales se obtiene una mayor amplitud para el caso en que el fotón gama se absorbe en el LSO con respecto al LuAP.

En particular, en México no existe aún ningún PET para estudios con animales. Esto se debe en parte al alto costo de los PETs comerciales que los hacen prohibitivos en laboratorios de investigación. Por otro lado, el desarrollo de los PETs más modernos descansa en el uso de las mismas técnicas que se requieren para desarrollar los detectores de frontera que se usan en la física de partículas elementales, a saber: cristales centelladores de alto Zef4 con tiempos de respuesta de decenas de nanosegundos, como los que se requieren el los calorímetros electromagnéticos del LHC en el Laboratorio CERN ubicado en Europa; arreglos compactos de detectores de luz con alta eficiencia cuántica como los PMTs de multiánodo, disponibles comercialmente, o los arreglos de fotodiodos (PD) y de diodos de avalancha (APDs) que se desarrollan actualmente en algunas universidades y laboratorios de investigación; electrónica rápida y de bajo ruido, similar a la que requieren los mismos detectores en física de altas energías; adquisición de datos con velocidades de centenas de KHz para detectores con decenas o centenas de miles de canales, exactamente como se requiere para los sub-detectores de un detector moderno como el CMS o el ALICE del CERN; software de simulación, similar al paquete GEANT que se usa en física de altas energías y software poderoso de reconstrucción y de análisis de datos como el paquete Root que también es una herramienta común entre los físicos de altas energías.



Asimismo, existe en México un núcleo de investigadores consolidados que poseen amplia experiencia en el uso de estas técnicas ya que algunos de ellos han participado y/o participan actualmente en forma activa en grupos experimentales en física de altas energías, y que a su vez están interesados en el desarrollo y la investigación en instrumentación y en su aplicación en física médica en nuestro país. El Dr. Francisco Javier Ramírez, del ININ, posee reconocida experiencia en el uso de detectores de radiación y en el diseño y construcción de la electrónica asociada. El Juan Jose Alvarado Gil, del CINVESTAV-Mérida, tiene experiencia en la aplicación de técnicas de espectroscopia fotoacústica al estudio de sistemas biológicos y en el diseño y aplicación de sensores para estudiar propiedades del latido cardiaco, los Drs. Humberto Salazar y Oscar Martínez, de la FCFM-BUAP, tienen amplia experiencia en el uso de detectores de rayos cósmicos por radiación Cherenkov y por fluorescencia, ambos miembros del Grupo Auger y el Dr. Salazar también miembro de la Colaboración CMS del LHC-CERN. El responsable de este proyecto ha trabajado desde 1985 con varios tipos de detectores de radiación ionizante, es miembro de la Colaboración Auger y de la Colaboración ALICE del LHC-CERN y ha sido el principal promotor de la creación del primer Centro ICFA de Instrumentación a nivel mundial, junto con otro en Estambul, apoyado por el Comité Internacional para Aceleradores Futuros (ICFA, formado por los directores de los laboratorios de física de partículas elementales más importantes del mundo) con sede en Morelia (ver, http://www.ifm.umich.mx/school/). En contraparte, existe también en México una componente de investigadores consolidados en el área de ciencias médicas y biológicas que se verán ampliamente beneficiados de complementar sus investigaciones en fisiología animal mediante imágenes de un PET experimental para animales. Esta componente está representada en este proyecto por el Dr. Elías Manjarez, del Instituto de Fisiología-BUAP y el Dr. Jorge Noel Quevedo Durán del Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del CINVESTAV en el DF. Ambos tienen amplia experiencia en el estudio de neuronales espinales relacionadas con la actividad espontánea basal, y con los circuitos neuronales generadores de la locomoción.
ORIGINALIDAD


  • El presente proyecto es original ya que se desarrollará un PET de alta resolución espacial para uso con animales con características superiores a los que existen actualmente en forma comercial para resolver un problema importante en neurociencias, ya que, respecto a la organización de las neuronas que generan actividad eléctrica basal espontánea, sólo se conoce su distribución bi-dimensional topográfica obtenida por métodos electrofisiológicos. El PET que se construirá en el presente proyecto permitirá explorar la localización tridimensional de neuronas espinales con actividad espontánea, en relación a la localización de aquellas neuronas que responden a la aplicación de estímulos sensoriales.

  • Desde el punto de vista tecnológico, este proyecto es original debido a que el PET para uso animal que proponemos construir usará cristales de alta densidad como los que se desarrollaron recientemente para la Colaboración CMS del LHC-CERN pero además usando dos diferentes tipos de cristales de dimensiones 2x2x10 mm3 posicionados enfrente de los pixeles de cada uno de los PMTs de multiánodo con el propósito de reducir la contribución del problema de la profundidad de la interacción, mencionado en la sección de antecedentes.

  • El diseño del PET se orientará hacia la obtención de una resolución espacial de 1.5 mm; esto representa un avance significativo hacia una resolución espacial cada vez más cercana a la impuesta por los límites físicos como mencionamos en la sección anterior.

  • Desde el punto de vista del diseño y construcción de la electrónica requerida, este proyecto es original ya que hasta donde sabemos no se han llevado a cabo en México implementaciones de sistemas electrónicos para procesamiento y adquisición de datos para un número de canales tan alto como el propuesto, 2304, leídos a una velocidad de adquisición tan alta como la que se requiere en este proyecto de alrededor de 300 KHz.

  • Este proyecto tiene potencial de ser original en el desarrollo de nuevos métodos de reconstrucción de las imágenes debido a la posibilidad de compararlos con los métodos ya propuestos usando datos reales en vez de simulaciones como hacen la mayoría de grupos de investigación en esta área que no cuentan con acceso a un equipo experimental.

  • El PET propuesto, en su condición de experimental, tendrá la ventaja adicional con respecto a un equipo comercial de que será modular y su configuración flexible, ya que el radio del anillo se podrá adaptar al tamaño del objeto biológico bajo estudio para optimizar la razón de señal a ruido. Asimismo, en caso de apoyarse este proyecto, en el futuro próximo se le podrán incorporar cámaras gama adicionales dentro del anillo para incrementar su eficiencia geométrica. Esto se haría usando otras tecnologías a modo de convertirlo en uno de los primeros PETs híbridos donde se podrían comparar las ventajas de las nuevas tecnologías que apenas se están desarrollando en base a fotodiodos PIN y a arreglos de diodos de avalancha (APD), como se menciona en la sección de Metodología.

  • Finalmente, esta propuesta multidisciplinaria es original porque contribuirá de manera significativa al desarrollo de la investigación y a la formación de recursos humanos en las áreas de fisiología del sistema nervioso en animales, y de instrumentación en el área de tomografía por emisión de positrones. De este modo se pretende crear en México un grupo actualmente inexistente que será capaz de realizar contribuciones científicas y tecnológicas innovadoras en el área de diseño, construcción y usos científicos de los tomógrafos por emisión de positrones tanto de los modelos actuales como de los que surgirán en el futuro próximo.

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