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Departamento de quimica farmacologica y toxicologica director de memoria


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UNIVERSIDAD DE CHILE

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica

EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE NANOPARTICULAS DE ORO CONJUGADAS AL PEPTIDO CLPFFD-NH2


PROFESOR

PATROCINANTE

Dr. Marcelo J. Kogan

DEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACOLOGICA Y TOXICOLOGICA



DIRECTOR DE MEMORIA

Dr. Juan Pablo Muñoz

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA CELULAR



DIRECTOR DE MEMORIA

Dr. Marcelo J. Kogan

DEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACOLOGICA Y TOXICOLOGICA



Memoria para optar al titulo de Bioquímico


HÉCTOR PABLO MARAMBIO RETAMAL

Santiago, Chile

2007

La naturaleza esconde su secreto porque es sublime, no por astucia”



Albert Einstein

AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, a mis padres, Laura Retamal y Héctor Marambio V., que a pesar de lo difícil que ha sido todo. Siempre han estado a mi lado, tendiéndome su cariñosa mano en mis tropiezos y apoyándome por sobre cada obstáculo.

A mi tía, Alicia Marambio, por su amor incondicional y apoyo sin cuartel durante toda mi vida.

A Marcelo J. Kogan, por la oportunidad de trabajar en un tema apasionante que me hizo amar, aún más, la ciencia.

A mi hermano del alma: Javier Wolnitzky Wenk, que ha estado siempre allí, entregándome su comprensión, cariño y fe.

A Marianela Sanchez, por su constante apoyo, cariño, comprensión y por enseñarme lo importante que es no dejar morir la magia en mi vida.

A Carla Delporte y Dante Miranda, que han sido para mí, grandes ejemplos. Por ser profesionales excepcionales, como por conservar en ellos la humildad que espero algún día alcanzar.

A Amalia Sapag de la Peña, por sus sabios consejos y excelente disposición.

A Ginéz Gonzalez, Rene Valdés, Italo Espinoza, Nicole Espinoza, Leonardo Sepúlveda, Stephanie Brain y Karina Navarrete. Grandes amigos, les agradezco por su apoyo a prueba de todo.

A Juan Pablo Muñoz, por todo lo que me ha enseñado en este bellísimo mundo que es la biología celular, así como su amistad. Le agradezco por sus conocimientos y buena fe.

A Dagoberto Soto, un grande sobre los grandes. Que aunque tomamos rumbos distintos, siempre estás en mi memoria y corazón por ser una gran persona y por sobretodo, un gran amigo.

A Fidel Albornoz, por todas las veces que me ayudaste en el laboratorio, con cosas que necesité y por haber sido siempre amable y respetuoso conmigo, te agradezco también por ese cálido saludo cada mañana.

A Guisela Muñoz, por tu eficiente trabajo, que sin duda apresuró mucho más el mío.

A Miguel Copaja, Pablo Aranguiz, Paulina Rojas, Rodrigo Almarcegui, Jorge Simon, Alan Letelier y Christian Smolic, compañeros de piso, con quienes he tenido la oportunidad de compartir momentos muy agradables.

A las bellas personas con las que tuve el honor de trabajar en Barcelona: Eliandre de Olivera, David Bellido, Meritxell Texido, Miriam Royo, Tommaso Cupido, Stephanie Boussert, Frank Sicherl, Luis Javier Cruz, Fernando Albericio y tantas personas más que fueron un gran apoyo y me entregaron su cariño cuando estaba lejos de mi hogar.

A todos los animales que entregaron su vida en pos de esta investigación. Espero, de todo corazón, que su muerte no haya sido en vano y esta memoria de pie a un bello descubrimiento.

A mis compañeros de laboratorio y a la facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas.



Finalmente al proyecto FONDECYT 1061142, al proyecto AECI A/3888/05 y al proyecto FONDAP 11980002 que hicieron posible este trabajo.

TABLA DE CONTENIDOS





Página

Agradecimientos………………………………………………………………………

ii

Tabla de Contenidos………………………………………………………………….

iv

Abreviaturas…………………………………………………………………………..

vi

Resumen……………………………………………………………………………….

viii

Sumary………………………………………………………………………………...

ix

1. Introducción………………………………………………………………………...

1

1.1 Marco Teórico……………………………………………………………………..

4




1.1.1 Obtención y caracterización de conjugados AuNP-péptido con potencial aplicación para la EA……………….……………………………


4







1.1.1.1 Conjugación de AuNP al péptido CLPFFD-NH2, capaz de reconocer los agregados amiloides tóxicos de A…………..................


4




1.1.2 Evaluación de la citotoxicidad de las AuNP y sus conjugados...…...

8







1.1.2.1 Ensayos de Citotoxicidad……………………………………….

8

1.1.3 Determinación de tipo de muerte celular, en cultivos de neuronas de hipocampo de rata E18………………………………………………….


9




1.1.3.1 Análisis de muerte celular……………………………………..

11




1.1.4 Determinación de la producción de especies reactivas del oxigeno (ROS), en cultivos de neuronas de hipocampo de rata E18………………


13




1.1.5 Análisis proteómico de cultivos celulares…………………………...

14

Hipótesis……………………………………………………………………………….

19

Objetivos……………………………………………………………………………….

20

Objetivo general……………………………………………………………………….

20

Objetivos específicos…………………………………………………………………..

20

2. Materiales y Métodos………………………………………………………………

21

2.1 Reactivos…………………………………………………………………………..

21

2.2 Materiales…………………………………………………………………………

22

2.3 Equipos……………………………………………………………………………

22

2.4 Kits………………………………………………………………………………...

23

2.5 Síntesis de AuNP………………………………………………………………….

23

2.6 Conjugación de AuNP a Cys-LPFFDNH2 (Pep)………………………………..

24

2.7 Concentraciones de AuNP……………………………………………………….

25

2.8 Toxicidad in vitro…………………………………………………………………

26




2.8.1 Cultivos celulares de línea Neuroblastoma SH-SY5Y……………...

26




2.8.2 Cultivos celulares de neuronas de hipocampo de rata E18………..

27




2.8.3 Tratamientos en cultivos celulares…………………………………..

29




2.8.4 Marcadores de viabilidad celular……………………………………

30




2.8.5 Determinación de los tipos de muerte celular en cultivos de neuronas hipocampales E18…………………………………......................


33




2.8.6 Evaluación de la producción de ROS en cultivos de neuronas hipocampales E18………………………………………….………………..


35




2.8.7 Evaluación del efecto de las AuNP sobre la expresión de Proteínas en cultivos celulares………………………………………………………...


38

3. Resultados y Discusión……………………………………………………………..

41




3.1 Caracterización de AuNP.………….………………………………….

41




3.2 Citotoxicidad de AuNP y AuNP-Pep.…………………………………

43




3.3 Efecto del tratamiento de AuNP y AuNP-Pep sobre el tipo de muerte en cultivos de neuronas hipocampales E18……………...………..


52




3.4 Evaluación de la producción de ROS en cultivos de neuronas hipocampales E18 tratados con AuNP y AuNP-Pep……………………...


55




3.5 Expresión de proteínas en cultivos neuronas hipocampales E18……

62

4. Conclusiones y Proyecciones……………………………………………………….

70

5. Bibliografía………………………………………………………………………….

74









ABREVIATURAS


NPM

CMO

RMN

AuNP

EC

A

EA

H+RMN

APP

BHE

AuNP-Pep

UV-Vis

TEM

MTT

DNA

LDH

NADH

NAD+

TdT

BrdUTP

TUNEL

GFP-LC3

AdLC3

ROS

DCF

H2DCFDA

NAC

SOD

MS

MALDI-TOF

ESI

HPLC

: Nanopartículas metálicas

: Campo magnético oscilante

: Resonancia magnética nuclear

: Nanopartículas de oro

: Enfermedades conformacionales

: Proteína beta amiloide

: Enfermedad de Alzheimer

: Resonancia magnética nuclear de protones

: Proteína precursora del Amiloide

: Barrera hematoencefálica

: Nanopartículas de oro, conjugadas al péptido CLPFFDNH2

: Espectrofotometría Ultra Violeta-Visible

: Microscopía de transmisión electrónica

: Bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)2,5 difeniltetrazolio

: Ácido Deoxiribonucléico

: L-lactato deshidrogenasa

: Nicotinamida adenina dinucleótida reducida

: Nicotinamida adenina dinucleótida oxidada

: Transferasa deoxinucleotidil Terminal

: 5 bromo 2’ deoxiuridina 5’ trifosfato

: Terminal Deoxinucleotide Transferase dUTP Nick End Labeling

: Proteína fluorescente verde-LC3

: Adenovirus-LC3

: Especies reactivas del oxigeno

: 2’,7’-di-clorofluoreceina

: Cloro-dihidro-fluoreceina-diacetato

: N-acetil cisteina

: Enzima Superoxido dismutasa

: Espectrometría de masas
: Desorción por laser asistida por matriz/tiempo de vuelo

: Ionización por electrospray

: Cromatografía liquida a alta resolución




RESUMEN
La nanotecnología, en la biomedicina, trabaja desarrollando herramientas, tanto de diagnóstico, como estrategias terapéuticas, menos invasivas y más eficientes que las actualmente en uso. Entre estas herramientas, se encuentran el uso de las nanopartículas metálicas (NPM), las cuales, siendo tan pequeñas tienen la propiedad de poder difundir a través de barreras biológicas, siendo capaces de llegar al sitio de interés terapéutico.

Las nanopartículas de oro (AuNP) poseen potenciales aplicaciones en el campo de la biomedicina, siendo una de ellas el diagnóstico y la terapia de la enfermedad de Alzheimer (EA). Recientemente, en nuestro laboratorio se demostró que es posible producir la desagregación de agregados tóxicos (AT) de la proteína β-amiloide (Aβ) involucrada en la EA mediante el uso de AuNP y la aplicación de campos magnéticos oscilantes. Para unir las AuNP a los AT de Aβ, las mismas se conjugaron al péptido CLPFFD-NH2, que presenta afinidad por Aβ, obteniendo los conjugados AuNP-CLPFFD NH2 (AuNP-Pep) .

En este trabajo de memoria se evaluó su neurotoxicidad. Para ello se realizaron ensayos de viabilidad, frente a cultivos de neuronas hipocampales extraídas de embriones de rata (E18) y Neuroblastoma SH-SY5Y.

Para el caso de las AuNP se encontró una leve disminución de la viabilidad respecto de los controles. Contrariamente, para AuNP-Pep, existe un aumento de la viabilidad celular que implica neuroprotección. Asimismo se evaluaron los efectos de los tratamientos en los mecanismos de muerte celular. Por otra parte, se determinaron los niveles de ROS producidos por las AuNP y las AuNP-Pep observándose que estas últimas presentan a tiempos tempranos de incubación un aumento de estas especies. También se estudió la producción de proteínas, en cultivos de neuronas, y se encontró un aumento en ciertas proteínas que, darían cuenta, de un efecto de “preacondicionamiento”, que contribuye a activar mecanismos de defensa que convierten a las neuronas en más resistentes.


SUMARY

EVALUATION OF THE CITOTOXICITY OF GOLD NANOPATICLES CONJUGATED TO THE PEPTIDE CLPFFD-NH2
The nanotecnology, in biomedicine, works in pursuit to develop diagnosis as therapeutic tools, with strategies less invasive and more efficient than nowadays in use. We can find the use of the metallic nanoparticles (MNP), which, being so small have the property of being able to spread across biological barriers, being capable of coming to the place of therapeutic interest.

The gold nanoparticles (AuNP) possess potential applications in the field of biomedicine, being one of them, the diagnosis and the therapy of Alzheimer's disease (AD). Recently, in our laboratory there was demonstrated that it is possible to produce the disaggregation of toxic attachés (TA) of the protein -amyloid (A) involved in the AD using AuNP and the application of magnetic oscillating fields. To join the AuNP to this TA of A the same ones were conjugated to the peptide CLPFFD-NH2, which presents affinity for A Obtaining the conjugate AuNP-CLPFFD-NH2 (AuNP-Pep).

In this report, there neurotoxicity was evaluated. For this assays of viability were realized, cultures of hippocampal neurons extracted from embryos of mice (E18) and Neuroblastome SH SY5Y.

For the case of the AuNP a slight decrease of the viability was reported, respect of the controls. Opposited of that, for AuNP-Pep, there exists an increase of the cellular viability that it implies neuroprotección. Likewise the effects of this treatments were evaluated in the mechanisms of cellular death. On the other hand, ROS levels produced by the AuNP and the AuNP-Pep were determined, being observed an increase of these species at early times of incubation Also the synthesis of proteins, in cultures of neurons, was studied and one found an increase in certain proteins that, they would realize, of an effect of "preaconditioning", that helps to activate mechanisms of defence that it will make the neurons in more resistant to injurys.



1. INTRODUCCIÓN
La nanotecnología, en la biomedicina, trabaja desarrollando herramientas, tanto de diagnóstico, como estrategias terapéuticas, menos invasivas y más eficientes que las actualmente en uso. Entre estas herramientas, se encuentran el uso de las nanopartículas metálicas (NPM), las cuales, siendo tan pequeñas tienen la propiedad de poder difundir a través de barreras biológicas, siendo capaces de llegar al sitio de interés terapéutico. Para dirigir selectivamente las NPM a la diana terapéutica, las mismas pueden conjugarse a moléculas con capacidad de reconocer selectivamente el sitio de acción.

Una característica común en los metales es que al ser sometidos a un campo magnético oscilante (CMO) pueden absorber energía de forma eficaz, disipándola en forma de calor. En el caso de las NPM, también están sujetas a esta característica, pero su carácter “nano” les entrega la cualidad de disiparla de forma local (nanométricamente), no afectando las estructuras aledañas a la que sería la diana terapéutica, lo que las ha llevado a ser utilizadas como agentes de hipertermia en el tratamiento de algunos tumores cancerígenos (1). Otra de las aplicaciones de las NPM es en diagnóstico, ya que las NPM pueden actuar como agentes de contraste mejorando la resolución de imágenes de tumores por RMN (2).

Entre estas NPM, se encuentran las nanopartículas de oro (AuNP), las cuales serían útiles en una gran cantidad de aplicaciones biológicas, debido a su tamaño y capacidad de difusión a diferentes zonas del organismo, entre las que cuentan ser agentes de liberación controlada de fármacos (drug delivery) y ser parte de andamiajes farmacológicos. También, se han utilizado como vectores de transfección, agentes de unión a DNA (3), inhibidores de proteínas, y marcadores espectroscópicos (4). Sin embargo, se ha encontrado que poseen toxicidad a elevadas dosis en cultivos de células mamarias (Cos-1) (4).

Las AuNP podrían ser utilizadas en la terapia o diagnóstico de algunas patologías denominadas enfermedades conformacionales (EC), las cuales tienen en común un carácter molecular, que se asocia con el mal plegamiento de proteínas, donde cambian su estructura secundaria, desde una conformación mayoritaria (soluble) a una conformación mayoritaria (insoluble), formando estructuras cuaternarias tóxicas para las células que circundan estos agregados (5). Entre las EC se encuentran la enfermedad de Huntington (6), la enfermedad de Creutzfeld-Jacob y otras patologías de carácter priónico (7), la amilodiosis (8), la diabetes mellitus no insulinodependiente (9), la enfermedad de Parkinson (10) y la enfermedad de Alzheimer (EA) (11), siendo esta última de gran importancia, tanto por su incidencia como por el impacto que tiene en los pacientes como en sus familiares.

Estudios preliminares, in vitro, desarrollados en nuestro laboratorio, evidenciaron que es posible producir la desagregación de agregados tóxicos de la proteína -amiloide (Aβ), involucrada en la EA, mediante el uso de AuNP y la aplicación de CMO (12). Con la finalidad de dirigir las AuNP a la diana terapéutica, en este caso los agregados tóxicos de Aβ, se conjugaron al péptido LPFFD NH2, que presenta capacidad para unirse selectivamente a agregados tóxicos de Aβ (Fig.1) (13).



LPFFD–NH2



Fig. 1 AuNP conjugada al péptido LPFFD-NH2.

Aun así, a pesar de todos los potenciales beneficios de los nanomateriales, es poco lo que se sabe del potencial efecto nocivo de los mismos, a corto y largo plazo, a nivel de la salud humana como medioambiental. Específicamente, se desconocen detalles sobre el efecto debido a su tamaño, forma y superficie (14). También desde un punto de vista farmacológico y toxicológico varios son los interrogantes por responder, como por ejemplo como es su distribución, metabolismo y excreción, cual sería su influencia en el metabolismo, y que mecanismo de degradación sufrirían estos nanomateriales (14).

Estudios recientes, mostraron que las AuNP recubiertas con especies catiónicas, tienen una toxicidad moderada, mientras que las recubiertas con especies aniónicas, casi no presentan toxicidad, en cultivos bacterianos (E.coli), de glóbulos rojos y células mamarias (Cos 1). Siendo, posiblemente, esta toxicidad dosis-dependiente mediada por características electrostáticas de las AuNP (21).

Por lo tanto, una solución para resolver el inconveniente de la toxicidad de los nanomateriales es la biocompatibilizacion. En el caso de las AuNP, pueden conjugarse a péptidos, logrando así que su toxicidad disminuya (14). Estos péptidos, además pueden otorgar a las AuNP, la capacidad de translocarse a través de membranas plasmáticas, siendo útiles en la entrega de fármacos (drug delivery), como ser reconocidas por receptores específicos de membrana. En resumen, estos péptidos, por un lado, pueden ser capaces de biocompatibizar a las AuNP y, por otro, entregarles a las AuNP la capacidad de ingresar en la mecánica celular normal (14).

Para un potencial uso de los conjugados péptido-AuNP, es necesario evaluar la citotoxicidad de estos nanobiomateriales, como un paso previo para un estudio in vivo en mamíferos.

Esta memoria de titulo “Evaluación de la citotoxicidad de nanopartículas de oro conjugadas al péptido CLPFFD-NH2” tiene como objetivo llevar a cabo un estudio de citotoxicidad de AuNP de 12nm y del conjugado AuNP-CLPFFD-NH2 (AuNP-Pep). Considerando el potencial uso del mencionado conjugado en el diagnostico y/o tratamiento de la EA.



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